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マウスのb-actinとGapdhの、リアルタイムPCR用のプライマーを設計したのですが、 どうしても偽遺伝子を避けることができません。 (NCBIのPrimer BLASTで確認すると、同じ長さの偽遺伝子がどう頑張っても 3個は出てしまう) B-actinの設計箇所はexon6〜exon7 Gapdhの設計箇所はexon4〜exon5 で、イントロンを挟むようにしています。

プライマーの長さは20base前後、PCR productsは100-200bpが理想です。 また、ゲノムについても、Primer BLASTで確認すると同じ長さのものが増えてしまいます。

色々試してみましたが、どうしてもうまくいきません。 この2つの遺伝子のmRNAだけが特異的に増える配列の設計方法、 あるいはラボで信頼性のある配列を使っている方がいらっしゃいましたら、 どうかアドバイスをお願いします。

質問日 Apr 14 '11 at 16:35

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porcine
1247


TaqMan probeが使えるならそれで特異性を上げると良いかもしれません。
AppliedBiosystems以外にもRocheにUniversal Probe LibraryというTaqMan probeがあり、なかなか低価格で便利です。
ゲノムからもBLAST上は増えるということですが、RTしてないネガコンで増幅が見られなければ(ゲノムDNAの混入がなければ)、それは問題ないかと思います。
また偽遺伝子がb-actinやGapdhのように発現が一定であるか、または発現していないと考えれば大きな問題もない気もします(厳密には気になりますが)。
実際にはもし偽遺伝子が多少発現していたとしても本物のb-actinやGapdhの発現量は非常に多いので無視できるレベルである気がいたします。
一番いいのはやはりTaqManですかね。

回答日 Apr 14 '11 at 17:18

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38brain
13133

ご回答どうもありがとうございます。 TaqMan probe検討してみます。

(Apr 15 '11 at 14:07) porcine porcine's gravatar image
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質問日: Apr 14 '11 at 16:35

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最終更新日: Apr 15 '11 at 14:07

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