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ノンモデル脊椎動物の次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析を計画しています。現在、totalRNAからmRNAの精製に取り組んでいますが、標準的なI社のoligo-dTセルロースを用いたキットで精製したところ、rRNAのコンタミが38%も出てきてしまいました。同じキットを使って2回精製しても33%で、ほとんど下がりませんでした。他のキットで、rRNAの混入を下げる工夫をしたキットが出ているようですが、お勧めなものを教えていただけませんでしょうか?よろしくお願いいたします。

質問日 Apr 28 '11 at 14:22

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sghr
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だいぶ前の記事への追記ですが、Invitrogen社のRibo-Minus Kitと、同Invitrogen社のRibo-Minus for RNA-Seq Kit(RNA-Seq用とうたっているもの)とEpicentre社のRibo-Zero Kitを比較検証してみましたので、皆さんのお役に立つこともあるかと思い結果をお伝えいたします。
下記ページに結果図を載せましたので、そちらをご覧いただくのが一番わかりやすいと思います。
http://twitpic.com/5w6ss7
結論を言いますと、Epicentre社のRibo-Zero Kitが最も圧倒的にrRNAを除去できていました。
縦軸(量)のレンジが異なりますが、Ribo-Minus KitではRNA-Seq用でも20%程度は残存していますが、Ribo-Zero Kitの方はほぼ0にまで除去できていました(start量は全てHumanの5ug total RNAで、精製後Agilent社Bioanalyzer2100 nano chipにて各100ng泳動)。
今回使ったRibo-Zero Kitはヒト・マウス・ラット用で他にも植物用などいくつか種類があるようですが、ノンモデル生物でどこまで除けるかは未知の部分もあります。
が、現状はRibo-Zero Kitを試行してみるのが一番良いように思われます。
(PolyAを持つものをターゲットとするなら+d(T)nによる精製で。)
Invitrogenの人にも伝えておいたので今後もしかしたらRibo-Minusも改善されるかもしれませんが(苦笑)。
ちなみにこのEpicentre社は今年Illuminaに買収されたようです。

回答日 Jul 27 '11 at 00:48

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38brain
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edited Jul 27 '11 at 00:54

RNA-Seqを行おうとしている者です。大変参考になりました! :-)

(Jul 27 '11 at 10:20) suimye suimye's gravatar image

dTセルロースで精製して38%は多い気がしますね。
invitrogen社からRiboMinus Eukaryote Kit for RNA-Seq(Cat#A1083708)というものが出ています。
5S, 5.8S, 18S, 28SのrRNAが最大で99.9%除去できると言ってますが、現実はそこまでではないものの大部分が除去できます。
私はこれを2回繰り返しています。
もっといい方法をご存じの方がいたら私もぜひ知りたいです。

回答日 Apr 28 '11 at 16:32

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38brain
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edited Apr 28 '11 at 16:32

ご回答ありがとうございます。 RiboMinusは私の周辺ではあまりいい成績を聞いていません(実験手技にもよるでしょうが)。他の製品でノンモデルでも使えるものは、、、と考えています。

(Apr 28 '11 at 19:52) sghr sghr's gravatar image

ではEPICENTRE Biotechnologies社のRiboZero rRNA Removal Kit
http://www.epibio.com/item.asp?id=576
はどうですかね。
直接比較したことはないですが。
実際の使用者の方の意見を聞いてみたいところです。

回答日 May 02 '11 at 17:31

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38brain
13133

ご回答ありがとうございます。 実は現在、そのキットが使用できるか検討しています。このkitの問題点は、動物種が限定される(human/mouse/rat)ということです。おそらくrRNAに特異的な配列を認識して除去するシステムだと思われるので、今回私が使用する、哺乳類か系統が遠い動物の場合使えるのかどうかわかりません。今メーカーとやり取りして使用可能か検討しています。

回答日 May 04 '11 at 10:29

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sghr
1111

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質問者です。Ambion社のpoly(A)purist MAB kitというものを使用してみましたのでご報告します。このキットはoligodT系ですが、wash条件などでコンタミを下げる工夫がされているようです。以前のキットでは38%のコンタミだったのが17%まで落ちました! このmRNAで解析に進むか、上記のRibZeroを使用するか、検討したいと思います。もし使用した場合はまたここで報告させていただきます。

(May 11 '11 at 09:18) sghr sghr's gravatar image
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質問日: Apr 28 '11 at 14:22

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最終更新日: Jul 27 '11 at 10:20

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