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いつも拝見させて頂いています。 早速質問なのですが、NGS(例えばillumina)でsequenceを読む前にライブラリをPCR増幅していますがそれは何のためにやっているのでしょうか?Alignmentするタグの数を増やしているからなのでしょうか?

質問日 Jun 30 '11 at 02:17

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DEF
41248


確かTruSeqの前のversionではfork adaptorが短くて(32~33mer)、それをライゲーションした後に、fork adaptor領域とフローセルにはえているプローブと相同な領域を含む長いPCR primer(~60mer)をくっ付けないと、フローセル上で増幅できなかったとおもいます。

TruSeqになってから、adaptor自体が長くなり(index付きで63~64mer)それ自体にフローセル上のプローブと相同配列を含みますが、最低1サイクル、PCRプライマー(22~23mer)でPCRをかけないと向きがそろわない(ライブラリーの端がforkの状態になったまま)ため、PCRをする必要があるのだと思います。増幅というより、端がちゃんと閉じた最終ライブラリーを作るためではないでしょうか。

参考PDF http://seqanswers.com/forums/attachment.php?attachmentid=687&d=1298656673 http://seqanswers.com/forums/attachment.php?attachmentid=57&d=1234113074 http://www.illumina.com/Documents/products/datasheets/datasheet_truseq_sample_prep_kits.pdf

回答日 Jul 08 '11 at 10:05

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yasugoyasu
2623

mya_ ♦さん どうも返信ありがとうございます。しかし、私が意図していた質問はブリッジPCRにおける蛍光検出のためのPCR増幅ではないのです。

私が意図していたのはブリッジPCRにかける前のライブラリを作成する時に何故PCR増幅が必要なのかということです。illuminaの次世代シークエンサーでは、ブリッジPCRの手順に入る時にはFlowセルにライブラリを流して1分子のアダプタ付きDNAフラグメントを結合させ、その1分子のDNAフラグメントをPCR増幅してコロニーにして蛍光を読み取ると思います。つまり、1分子に由来する蛍光を検出し配列を読み取っていることになります。それならばライブラリを作成する時にわざわざPCRで増幅しなくてもアダプターをつけただけのDNAサンプルをflowセルに流して次世代シークエンサーをrunすればサンプルの配列を読むことができるのではないかと思ったのです。

回答日 Jul 04 '11 at 02:02

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DEF
41248

yasugoyasuさん  

返信ありがとうございます。添付のpdfファイルを見て色々と分かってきました。おっしゃる通り、端を閉じたライブラリを作るためにPCRしているようですね。また、本来はそういう目的のためにPCRを行っているようですが、どうしても増幅されてしまう配列が出てきてしまうのでPCR biasがかかってしまいChIPseq等の解析を複雑化させてしまうことがあるようですね。

回答日 Jul 15 '11 at 18:02

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DEF
41248

勉強不足のため、間違っていたらすいません。 第2世代型(アイオントレントPGM除く)までは、塩基配列を読み取る時に必要な蛍光反応に十分な強度をもたせるためにサンプルDNAを増幅しているかと思います。

第1世代のsanger法シーケンサーでは事前に大腸菌にサンプルを組み込んで増幅して(更に、同一サンプルから、ランダムに長さの違う蛍光標識された断片を得る為にPCRを行います)
第2世代型ではエマルジョンPCRもしくはブリッジPCRなどの超小型反応系を用いて増幅しています。
第3世代の1分子シーケンサー、だとPCRを行わないのですが、追っていないため詳しく知りません。

スラッシュドットの個人ページのリンクを張っておきます。
1. http://slashdot.jp/~kaho/journal/437301
2. http://www.ddbj.nig.ac.jp/ddbjing/dl/21-5-1.pdf

回答日 Jul 03 '11 at 13:03

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mya_ ♦
3881914

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質問日: Jun 30 '11 at 02:17

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最終更新日: Jul 15 '11 at 18:02

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