ログイン 概要 よくある質問

MiSeqを使ってmouse macrophage系細胞のRNA-seqを始めたのですが、出てきたデータの塩基組成がA,T=32%、G,C=18%と偏ります。 原因に心当たりのある方、アドバイス頂けないでしょうか?

実験系の概略は以下のとおりです。

  • Total RNA 1 ugを精製
  • TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kitでlibrary構築
  • Sequencing Kit V3 (150cycle)でpaired-end readsを取得

よろしくお願いいたします。

質問日 Apr 06 '15 at 17:38

junya's gravatar image

junya
11

ライブラリーを作り直すことで、ATバイアスは消えました。 原因は不明のままですが、同じ状況になった方の参考になれば幸いです。

(Apr 13 '15 at 19:24) junya junya's gravatar image

ATGCの合計が50%しかないんですが、残りの50%は何なんでしょうか?

回答日 Apr 06 '15 at 18:43

aki's gravatar image

aki
861

a=32%, t=32%, g=18%, c=18%

表記が雑で大変失礼いたしました。ご検討よろしくお願いいたします。

回答日 Apr 08 '15 at 14:06

junya's gravatar image

junya
11

こんにちは。 ATバイアスがあるとのことですが、これはfastqcなどの品質評価をみてATバイアスがあったということでしょうか。ライブラリーを作成し直した場合に上手くいったとのことでですが、私は原因を探ってみる方がいいと思います。
情報が少ないですので、ATrichになった場合と成功した場合の以下の項目はどうなっているでしょうか。

  1. まずそもそも、失敗時と成功時はstarting materialのtotal RNAは同じlotものを使ったのでしょうか?
  2. fastqcなど品質評価のときのアダプターやindexのコンタミ量の違い。
  3. 失敗時と成功時のlibraryを作成したときのstarting materialの RNA量の違い。
  4. 失敗時と成功時のlibraryを作成したときのlibrary qPCRの定量結果が極端に多すぎていないか。
  5. reference genomeにmappingしたときのmapping効率

もう少し検討する項目はあると思いますが、かならず失敗時と成功(?)時は違いがあるはずと存じます。

ちなみにRNA-seqではありませんが、DNA-seqやChIP-seqのときはDNA sharingとgel extractionの具合で、 GC-richなshort fragmentが除去されることで、AT-richになることがあります。

@suimye

回答日 Jan 05 '16 at 17:58

suimye's gravatar image

suimye
2961415

あなたの回答
プレビューをトグルする

この質問をフォローする

By Email:

Once you sign in you will be able to subscribe for any updates here

By RSS:

回答

回答とコメント

タグ:

×11
×1
×1

質問日: Apr 06 '15 at 17:38

閲覧数: 2,154 回

最終更新日: Jan 05 '16 at 17:58

powered by OSQA