Answers to: DNaseを完全に効かせるにはどうすればよいですか

Answer by okubo

okubo — Thu, 19 May 2011 02:40:42 +0900

２０年前の知識だと思って読んでください。ゲノムＤＮＡを出発材料にしてＰＣＲ増幅で何も増えないことが確認できるまで練習をしてください。

DNase処理して熱処理でと書かれていますが　DNaseI でしたらendosunlease ですから短くなっても短い断片ができるだけです。PCRはたいていかかります。　系から除くには　DNaseIの後で　exonuclease I や　III でオリゴやモノまでかじる必要があります。さもないとこれらのＳＳは鋳型として働くでしょう。

ゲノムで練習し間違いない条件をつくってから本番に臨んでください。

Comment by porcine on 38brain's 回答

porcine — Mon, 18 Apr 2011 15:41:20 +0900

早急なご回答ありがとうございます。イントロンを挟んたプライマーを設計していますが、どうも偽遺伝子が多く、mRNAも、ゲノムからも同じ長さのものが増えてきていることが判明しております（ちなみにb-actinとGapdhです）。実験の内容上、どうしても多少でも残っていると問題になってしまいます。 1〜30細胞という微量な材料でやる予定ですので、あまり多くの行程を経るとmRNAそのものがなくなってしまうので、なるべく少ないステップを希望しております。

Answer by 38brain

38brain — Mon, 18 Apr 2011 15:28:02 +0900

書くまでもないことかもしれませんが、ゲノムからは増えない、あるいは増幅長が異なるようにintronを挟むか2つのexonにまたいでプライマーを設計することができるようであればゲノムが多少残っていても問題なくなります。
この辺の基本的な部分は同じラボの詳しい人に聞いた方が早いかもしれませんね（いないのであればしょうがないですけど）。
うちではRNAの精製の時にDNase処理を含むQiagenのRNeasy Micro Kitで精製後、さらに逆転写時にQiagenのQuantiTectなんちゃらキットというGenomeを除去しつつ逆転写する試薬を使ってcDNAを作製してます。
それでも高感度のTaqManなどの結果を見ると100%完全にゲノムの混入をなくすというのは難しいようなので、最初からゲノムの混入を気にせずに済む増幅産物を得られるように設計した方が良いでしょうね。