Answers to: ノンモデル生物のmRNA精製でrRNAのコンタミをなるべく下げたい

Comment by suimye on 38brain's 回答

suimye — Wed, 27 Jul 2011 10:20:04 +0900

RNA-Seqを行おうとしている者です。大変参考になりました！　:-)

Answer by 38brain

38brain — Wed, 27 Jul 2011 00:48:51 +0900

だいぶ前の記事への追記ですが、Invitrogen社のRibo-Minus Kitと、同Invitrogen社のRibo-Minus for RNA-Seq Kit（RNA-Seq用とうたっているもの）とEpicentre社のRibo-Zero Kitを比較検証してみましたので、皆さんのお役に立つこともあるかと思い結果をお伝えいたします。
下記ページに結果図を載せましたので、そちらをご覧いただくのが一番わかりやすいと思います。
http://twitpic.com/5w6ss7
結論を言いますと、Epicentre社のRibo-Zero Kitが最も圧倒的にrRNAを除去できていました。
縦軸（量）のレンジが異なりますが、Ribo-Minus KitではRNA-Seq用でも20%程度は残存していますが、Ribo-Zero Kitの方はほぼ０にまで除去できていました（start量は全てHumanの5ug total RNAで、精製後Agilent社Bioanalyzer2100 nano chipにて各100ng泳動）。
今回使ったRibo-Zero Kitはヒト・マウス・ラット用で他にも植物用などいくつか種類があるようですが、ノンモデル生物でどこまで除けるかは未知の部分もあります。
が、現状はRibo-Zero Kitを試行してみるのが一番良いように思われます。
（PolyAを持つものをターゲットとするなら＋d(T)nによる精製で。）
Invitrogenの人にも伝えておいたので今後もしかしたらRibo-Minusも改善されるかもしれませんが（苦笑）。
ちなみにこのEpicentre社は今年Illuminaに買収されたようです。

Comment by sghr on sghr's 回答

sghr — Wed, 11 May 2011 09:18:00 +0900

質問者です。Ambion社のpoly(A)purist MAB kitというものを使用してみましたのでご報告します。このキットはoligodT系ですが、wash条件などでコンタミを下げる工夫がされているようです。以前のキットでは38%のコンタミだったのが17%まで落ちました! このmRNAで解析に進むか、上記のRibZeroを使用するか、検討したいと思います。もし使用した場合はまたここで報告させていただきます。

Answer by sghr

sghr — Wed, 04 May 2011 10:29:37 +0900

ご回答ありがとうございます。実は現在、そのキットが使用できるか検討しています。このkitの問題点は、動物種が限定される(human/mouse/rat)ということです。おそらくrRNAに特異的な配列を認識して除去するシステムだと思われるので、今回私が使用する、哺乳類か系統が遠い動物の場合使えるのかどうかわかりません。今メーカーとやり取りして使用可能か検討しています。

Answer by 38brain

38brain — Mon, 02 May 2011 17:31:11 +0900

ではEPICENTRE Biotechnologies社のRiboZero rRNA Removal Kit
http://www.epibio.com/item.asp?id=576
はどうですかね。
直接比較したことはないですが。
実際の使用者の方の意見を聞いてみたいところです。

Comment by sghr on 38brain's 回答

sghr — Thu, 28 Apr 2011 19:52:25 +0900

ご回答ありがとうございます。 RiboMinusは私の周辺ではあまりいい成績を聞いていません(実験手技にもよるでしょうが)。他の製品でノンモデルでも使えるものは、、、と考えています。

Answer by 38brain

38brain — Thu, 28 Apr 2011 16:32:00 +0900

dTセルロースで精製して38%は多い気がしますね。
invitrogen社からRiboMinus Eukaryote Kit for RNA-Seq（Cat#A1083708）というものが出ています。
5S, 5.8S, 18S, 28SのrRNAが最大で99.9%除去できると言ってますが、現実はそこまでではないものの大部分が除去できます。
私はこれを2回繰り返しています。
もっといい方法をご存じの方がいたら私もぜひ知りたいです。