Answers to: NGSライブラリのPCR増幅

Answer by DEF

DEF — Fri, 15 Jul 2011 18:02:23 +0900

yasugoyasuさん　　

返信ありがとうございます。添付のpdfファイルを見て色々と分かってきました。おっしゃる通り、端を閉じたライブラリを作るためにPCRしているようですね。また、本来はそういう目的のためにPCRを行っているようですが、どうしても増幅されてしまう配列が出てきてしまうのでPCR biasがかかってしまいChIPseq等の解析を複雑化させてしまうことがあるようですね。

Answer by yasugoyasu

yasugoyasu — Fri, 08 Jul 2011 10:05:48 +0900

確かTruSeqの前のversionではfork adaptorが短くて（32~33mer）、それをライゲーションした後に、fork adaptor領域とフローセルにはえているプローブと相同な領域を含む長いPCR primer（~60mer）をくっ付けないと、フローセル上で増幅できなかったとおもいます。

TruSeqになってから、adaptor自体が長くなり（index付きで63~64mer）それ自体にフローセル上のプローブと相同配列を含みますが、最低１サイクル、PCRプライマー(22~23mer）でPCRをかけないと向きがそろわない（ライブラリーの端がforkの状態になったまま）ため、PCRをする必要があるのだと思います。増幅というより、端がちゃんと閉じた最終ライブラリーを作るためではないでしょうか。

参考PDF http://seqanswers.com/forums/attachment.php?attachmentid=687&d=1298656673 http://seqanswers.com/forums/attachment.php?attachmentid=57&d=1234113074 http://www.illumina.com/Documents/products/datasheets/datasheet_truseq_sample_prep_kits.pdf

Answer by DEF

DEF — Mon, 04 Jul 2011 02:02:48 +0900

mya_ ♦さんどうも返信ありがとうございます。しかし、私が意図していた質問はブリッジPCRにおける蛍光検出のためのPCR増幅ではないのです。

私が意図していたのはブリッジPCRにかける前のライブラリを作成する時に何故PCR増幅が必要なのかということです。illuminaの次世代シークエンサーでは、ブリッジPCRの手順に入る時にはFlowセルにライブラリを流して1分子のアダプタ付きDNAフラグメントを結合させ、その1分子のDNAフラグメントをPCR増幅してコロニーにして蛍光を読み取ると思います。つまり、1分子に由来する蛍光を検出し配列を読み取っていることになります。それならばライブラリを作成する時にわざわざPCRで増幅しなくてもアダプターをつけただけのDNAサンプルをflowセルに流して次世代シークエンサーをrunすればサンプルの配列を読むことができるのではないかと思ったのです。

Answer by mya_

mya_ — Sun, 03 Jul 2011 13:03:48 +0900

勉強不足のため、間違っていたらすいません。第２世代型（アイオントレントPGM除く）までは、塩基配列を読み取る時に必要な蛍光反応に十分な強度をもたせるためにサンプルDNAを増幅しているかと思います。

第１世代のsanger法シーケンサーでは事前に大腸菌にサンプルを組み込んで増幅して（更に、同一サンプルから、ランダムに長さの違う蛍光標識された断片を得る為にPCRを行います）
第２世代型ではエマルジョンPCRもしくはブリッジPCRなどの超小型反応系を用いて増幅しています。
第３世代の１分子シーケンサー、だとPCRを行わないのですが、追っていないため詳しく知りません。

スラッシュドットの個人ページのリンクを張っておきます。
1. http://slashdot.jp/~kaho/journal/437301
2. http://www.ddbj.nig.ac.jp/ddbjing/dl/21-5-1.pdf