Answers to: UCSC Genome Browserからのファイルアクセスに対応したBAM置き場

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ksfk — Tue, 11 Mar 2014 06:40:20 +0900

ご指摘いただきありがとうございます。染色体の扱いについて大きな勘違いをしておりました。ヒトゲノムのバージョンがhg19であることは検査会社に確認をとりました。BAMファイルが私のものであることは私のSCN4A変異の位置でカバレージは少ないながらカウントが存在するので、一旦BAMファイルを信頼しようと思います。VCFファイルを自分で作り直すことも見当しましたが、Windows環境で済ませる自信がないので、VCFとBAMの間で10点ほど比較して一致を確認し、VCFファイルについても検査会社から受け取ったものを信頼することにします。アノーテーションの作業に入ろうと思うのですが、AnnovarよりもGene-Talkを使う方向で考えています。現段階で劣性遺伝、人口頻度0.1%未満、Functionalに限っても100点ほどdbSNPに登録のあるSNPがあるので、なんとか効率よく行う方法を探しているところです。

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nob_fj — Sun, 09 Mar 2014 19:47:25 +0900

私は多型解析の専門と言える立場に無い点と、データの解釈に踏み込んだ点を遺伝カウンセラーのように発言できる立場にはないという前提でご参考程度にコメントいたしますと、「染色体２本分のトラックが表示される」の意味するところが良く分りませんが、一般的なゲノムブラウザでは、BAMファイル1つにつき、1トラック表示されるのが普通だと思います。細かい話をすると、

IGV(や確かGenomeJackも)1トラックにつき、リードレベルの表示と、カバレージを示す波形表示が1トラックにつき1つずつでます。
幣所(国立遺伝学研究所)のGenomeExplorerでは、データロード時に順鎖方向と逆鎖方向を別トラックに入れる選択もできます。が、多型解析ではこれらを順鎖/逆鎖を区別しないで利用する場合のほうが普通です。

おそらく、私の想像ですが、染色体２本分のトラックの意味が、父由来、母由来のそれぞれを意味しているのであれば、 BWAやBowtieなど私が知る範囲での一般的にexome解析で利用されるマッピングツールは、父由来/母由来の染色体を分けてマッピングする能力はありません。ので、結果として出力されるBAMも父由来、母由来両方由来のDNAが、 1トラックに混在した状態で表示されます。多型がヘテロである場合は約50%のリードが変異ありとなります。

多型の箇所を示すVCFファイルを作成するSNVコールのプログラムも、基本的にはこのパーセンテージや、配列の品質などを考慮して、変異がヘテロなのか、ホモなのか、シーケンサー由来などのノイズなのかを判定します(実際にはもっと複雑な計算式を使っていますが)。

もう一点、別の観点での注意点ですが、マッピング結果のBAMファイルを取得した際の、ヒトゲノムのバージョンはhg19/GRCh37ですかhg18、GRCh36ですか。たぶんないとは思いますがhg38/GRCh38という最新版もあります。これの指定を誤ると、変異の箇所が実際と異なる表示になるので注意が必要です。

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ksfk — Sun, 09 Mar 2014 07:07:27 +0900

ご回答ありがとうございます。IGVで表示することができました。しかし、染色体２本分のトラックが表示されるものと思っていたのが、１トラックしか表示されません。これが染色体１本分しかシーケンシングできていないのか、あるいは、BWAを使ってFASTQファイルからBAMを作り直せば２本分取り出せるのか、どちらなのか悩んでいます。検査会社にも問い合わせているところです。

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ksfk — Fri, 07 Mar 2014 18:12:32 +0900

ご回答をいただきまして、ありがとうございます。示していただいたSRX000350_SRR001356_1000.bamで現在試しているところですが、こちらでもDropboxでエラーが出ます。Galaxyの方は[display at UCSC main]をクリックして表示したところエラーが出ず、初めてうまく表示されたようです。このときにBAIファイルをアップロードしなかったので、おそらくBAMをアップロードすると自動でBAIもアップロードされるのではないかと思います。その一方で、sortとindexをほどこしたGRC13290252-48725-D1_post_withBAI_sorted.bamを作って、SRX～ファイルと全く同じようにGalaxyにアップロードしたのですが、こちらは相変わらず"Byte range request was ignored by server"のエラーが表示されます。教えていただいたIGVの方も試してみます。

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nob_fj — Fri, 07 Mar 2014 17:09:14 +0900

track type=bam bigDataUrl="http://cell-innovation.nig.ac.jp/export/public/ucsc_101201/SRX000350_SRR001356_1000.bam" は現在でもうまくいくので、ファイルの問題と、データ置き場の問題を切り分けるために、今試そうとされているデータ置き場に上のSRX000350_SRR001356_1000.bamとSRX000350_SRR001356_1000.bam.baiをダウンロードして参照できるか試してはいかがでしょうか。うまくいくのであれば、データの問題、いかないのであれば、データ置き場の問題。

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nob_fj — Fri, 07 Mar 2014 16:56:54 +0900

ファイル名はfileName.bamとfileName.bam.baiの形式だと過去試した限りは動作しました。fileNameの部分は任意の英数字で大丈夫だとは思います。bamとbaiはセットで名前を統一しておかなければだめだと思います。ただ、今自分もdropboxを再度試してみましたが、過去ううまくいっていた記述でエラーが出ていましたので、dropboxからはうまく通信できなくなったのかも知れませんね。よく調べたわけではないですが。

Answer by nob_fj

nob_fj — Fri, 07 Mar 2014 15:51:36 +0900

カバレージをご参照になりたいとの件、私の個人的見解ですが、少なくとも、データを公開状態にしてのUCSC Genome browserは第一選択肢ではなく、多型解析であれば、windows環境でも動作し、データをローカルなディスクに置いておける(公開しない) IGVなどを使うのが妥当のような気がします。IGVは多型解析に特化して開発されている印象がありますし、世界中の研究者が利用しています。

また同じくwindows上でも動作する、国内企業の三菱スペース・ソフトウエア株式会社が開発されているGenomeJackも選択肢の一つかと思います。

Webサーバ系なので、幣所サーバにアップロードする形になりますが、幣所でもGenomeExplorerというゲノムブラウザを一般利用開放しており、BAMファイルをアップロードくだされば参照することはできますし、セキュアなプロトコルで通信を暗号化しており、他のユーザーからはデータ閲覧されないので、公開状態でUCSC Genome Browserで閲覧するよりははるかに安心してご利用いただけます。 SNPモードではSNVだけでなく、挿入、欠損も見ることができます。ただし、個人からの利用申請を受理できるかは、私個人の範疇・権限を超えますのでご了承ください。

注)UCSC Genome Browserも私が過去調べた際は、BASIC認証のセキュアプロトコルでのアクセスも利用可能でした。

UCSC Genome BrowserでBAMを参照するには、BAMファイルがソート済みかつ、インデックスファイル(.bai)が作られおり、bamと同じくアクセスできる場所に配置されている必要があります。 samtoolsもwindowsで動作します。拙文ですが、samtoolsのコマンドでの利用方法を記載しています。 NGS Surfer's Wiki(samtools) 3. bamソートと 4. bam index作成を実行します。ただ、ブラウザによっては、bamのソートやindex付加を必要としないはずなので、まずはそちらを試してはいかがでしょうか。

Windows環境でsamtools使う場合、私ならCygwinをインストールして、windows環境上でUNIX/Linuxライクな動作環境から動作させます。試したことは無いですが、コマンドプロンプトから動作させることもできるかもしれません。どちらも、それなりにいろいろ調べる必要があると思います。

尚、ご質問の文案を見た上で、ksfk様のご質問の「カバレージを見る」が、こちらにmkodaさんが記載されているような特定領域のdepth of coverageの正確な数値を調べたいということでなく、ブラウザで何配列カバーしているか確認したいという意図だと思いましたのでそのように回答いたしました。

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ksfk — Fri, 07 Mar 2014 15:31:01 +0900

ご心配いただき恐縮です。確かに、仰るとおり私自身のexomeを公開するのはリスクのある行為です。しかし、私にはこうならざるをえない事情があるのです。日本では柳澤桂子さんの「認められぬ病」という書籍で知られているように、少なからず原因が分からないまま確定診断が得られず、放置される患者が存在します。希少疾患ゆえの患者数の少なさと、ゲノムの全領域に渡ってあまりにも多様に原因変異が分布するためです。遺伝子に原因があると特定されたわけではありませんが、私自身もそういった患者の一人だと思っています。理論的、確率的にはどんなに稀な病気、極端な話、世界に一人だけの疾患でもありうるのが現実です。ですから、私自身としては、こう思うのです。exomeを公開することで、少しでも診断に結びつくかもしれない情報を得られて、もしも子孫が私同様に発症したとしても研究が前向きに進むのであれば、私自身の判断で自分のexomeを公開するという行為はかろうじて許されるであろうと。２年前にexomeシーケンシングを受けると決めた時以来、そう割り切ることに致しました。このような事情を飲み込んでいただくのはすぐには困難かもしれませんが、ここは私自身のexomeが公開されているという問題には、なにとぞご寛容に考えていただけるとありがたく思います。

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nob_fj — Fri, 07 Mar 2014 14:47:07 +0900

質問の本筋とは関係のないコメントですが、私自身はバイインフォマティクスも取り扱っているIT系技術者で研究者でも、遺伝カウンセラーでもなんでもないので、個人的な見解ですが、ksfk様の質問文に記載されているデータが、テストデータでなく、exomeデータのそのものなのだとすると、公開状態になっているのを今一度考え直したほうが良いように思います。私個人とては公開状態を止めることをお奨めします。遺伝疾患に関係する多型情報はご自身のみならず、血縁者様の個人情報ともなりえます。技術的な点についてはまた、別途コメントします。

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ksfk — Fri, 07 Mar 2014 10:40:43 +0900

おっしゃられているindexファイルというのはBAIファイルと呼ばれているもののことだと思うのですが、実はこれの生成の仕方も分からなくて困っています。詳しい事情を質問に追加して記入いたします。

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nob_fj — Fri, 07 Mar 2014 10:32:39 +0900

dropboxの有償アカウントで試したことはないので分らないですが、念のため確認ですが、bamファイルはソート済みで、ソート済みbamに対するindexファイルは作成されていますか？