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お世話になります。実験科学は素人なのでご指導お願いします。（実験は共同研究機関や外注会社にお願いしています） ウィルス変異株の量（viremia)が病気の重症度と関係があるか調べたいと思っています。 たとえば、ある病原性ウイルスに株１、株２、株３の三つがあるとします。 これらの差異は微妙な点突然変異でアミノ酸の違いもわずかであり、それらの違いを区別するPCR primerはまだ設計されていません。おのおのの検体中で株１、株２、株３の「量的」な違いを調べるにはどうすればよろしいでしょうか？ PCRベースの実験ではどうすれば可能でしょうか？ あるいは、株１，２，３に共通のprimerでPCRしておいて（あるいはPCRはなしで）、イルミナにかけたのち、株１，２，３おのおののReferene 配列にmapされるread数を比較してもいいように思います。しかしウィルス量がlog copy/mLのような絶対的な単位ででないのが信頼度の面でどうかなと思いますのと、mapされたread数の多寡がウィルス量の多寡といえるのか自分でもよくわかりません。統計解析するにしてもRead数の%を独立変数としてよいのかどうか。。。また、検体の数が増えてくると処理やコストが（PCRに比して）たいへんになってくるのでは、と危惧しています。 微妙なウィルス変異株の定量方法についてご指導ください。 |
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細胞内寄生ウイルスのコピー数でしょうか？ 10X Genomicsの1細胞用のキットはどうでしょうか？ https://www.scrum-net.co.jp/topics/2016/0725 相談されるといいと思います。 |
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貴重な情報ありがとうございます。 いまは やはり deep sequencingで量的な評価をしようと思っています。 ウィルスの量的評価には、PCRだと特異的すぎて、primer 領域に変異がおきているとまったく検出されません。さらにtaqManするとなるとtaqManのPrimer領域に変異がないことも保証されている必要がありますし。 また、PCRでひっかかっても、ウィルスの微妙な変異株の量的比較はできませんので。 今後ともご指導のほどよろしくお願いします。 |
