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mRNA-Seqの情報解析で、なぜかrRNAが混入することが多いようですが、 これを除去するのに使用するrRNA、tRNAの情報はどこから入手するのが一般的でしょうか。 もし自前で除去スクリプトを作成する必要がある場合は、rRNA、tRNAの座標情報をUCSCのどこかから入手し、 マッピング結果中のrRNA、tRNAにヒットした結果レコードを除外するなどの 対応を考えていますが、もっと効率的なツール・方法があったら教えてください。 |
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良く調べたら、同じ質問がSEQAnswersにもありました。 こちらの回答では、BEDtoolsを使用するようですが、あらかじめBED形式のrRNA,tRNA座標情報を用意しておく必要があるようです。 どちらがやりやすいか検討してから対応を行ってみます。 tRNAの座標に関しては、UCSCのTable browserでgroup="Genes and Gene Prediction Tracks"のtrack="tRNA Genes"からBEDフォーマットで入出できそうです。 rRNAがどこにあるかはまだ分かっていません。 hacchyさんgaouさんからいただいたヒントを元に、 BAMファイル中のrRNA、tRNAを除去する方法が分かりました。 以下のwikiにまとめてあります。 私自身が確認したわけではないですが、cufflinksを使用したフローでもTopHatが出力するSAMを上記処理でフィルタリング可能という話を聞きましたので、質問は一旦閉じさせていただきます。もし間違っていたら、質問の再開をお願いします。 |
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生物種はマウスでしょうか？ 一般的かどうかは分かりませんが，私は Ensembl API を使ってアノテーションの取得をしています。 Ensembl Genome Browser にある全てのアノテーションを柔軟に取得することができるので，tRNA の位置情報を取得したり，その配列を取得したり，mRNA-seq データから遺伝子ごとの RPKM を計算するときに必須なエキソンの位置を取得したり，という処理を短いコードで書けるので，愛用してます。 ヒト/マウスであればアノテーションはある程度しっかりしていると思いますが，Ensembl 生物種の中にも tRNA のアノテーションが足りなかったりする場合もあるようです。そのような場合は，tRNA-SE などを自前で動かして，ncRNA 領域の予測を行うと良いそうです。 また，Ensembl にないような生物種は，GenBank ファイルか GFF ファイルがある場合が多く，BioPerl ベースのパーサを作って情報を取得しています。 生物種はヒトなので、Ensembl APIを試してみます。 できたらやり方をwikiにアップしようと思います。 申し訳ないですが、Ensembl APIですが、サーバ環境が直接外に出られないので、ちょっと敷居が高そうです。ローカルにデータをもって来てMySQL dbを構築する手もありますが、このためだけに行うにはちょっと作業負荷が高そうなので、他の方法を探したいと思います。 |
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私はお手軽にはとりあえずCufflinksかけてしまって、予測されたtranscriptに対してRepeatMaskerかけちゃったりしています。 素人質問で申し訳ないですが、RepeatMaskerにかける際の、クエリとリファレンスはどうなるのでしょうか。 クエリはcufflinksをかけたあと、gtfの座標をもとに簡単なスクリプトでtranscriptのfastaファイルを作って使っています。Repeatmaskerのリファレンスは普通にRepbaseで、いろんなものがヒットしますが、RNAに該当するものだけを除去する（こちらも簡単なスクリプト、というかgrep）ようにしています。 gaouさん もしご存知でしたら Repbaseから直接取得したわけではないのですが、 UCSCのTable browserで "Variation and Repeats"のカテゴリに"RepeatMasker"という トラックがあり、このカラムの "repClass"のカラムが以下のような構成になっており、 このうちtRNA,rRNAのもののみ抜き出せば、 gaouさんのフィルタリング対象と同じになるのではないかと 思いますが、違いますでしょうか。 $ awk '{print $12}' allFieldsFromSelectedTable.txt | sort | uniq -c
461751 DNA
1881 DNA?
1498690 LINE
51 LINE?
717656 LTR
122 LTR?
371543 Low_complexity
3733 Other
2236 RC
729 RNA
1793723 SINE
425 SINE?
9566 Satellite
417913 Simple_repeat
7036 Unknown
97 Unknown?
1769 rRNA
1 repClass
1340 scRNA
4386 snRNA
1481 srpRNA
2002 tRNA
基本的にはそうだと思います。汎用的に使うためにはRepeatMasker自前でかけた方が楽かとは思いますが。 UCSCのアノテーションがない生物種でも、RepeatMaskerベースの方法論であれば、ゲノムが決定しており、マッピング出来さえすれば、その情報を使用して、 教えていただいて恐縮ですが、現在cufflinksはまだ導入できておらず、
cufflinksベースの解析フローが出来たら再度gaouさんのフローを試してみる予定です。対応には暫くお時間いただきたいと思います。
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